Azterketa genetikoak egiteko prozesuan, askotan, RNA lagin nahikorik ez dugu topatzen, adibidez, ahoko tumore anatomiko txikiak aztertzeko, baita zelula bakarreko laginak ere, eta giza zeluletan oso maila baxuan transkribatzen diren gene-mutazio espezifikoen laginak aztertzeko.Noski, COVID-19 probarako, laginak hartzen ez badira leku egokian edo nahikoa aldiz ez badaude, laginaren tamaina oso txikia izango da, horregatik Osasun eta Familia Plangintza Batzordea duela bi egun atera zen eta proba gainditu du, eta azido nukleikoen laginak sei lagin hartu ez baditu, horren berri eman dezakezu.
Erreaktiboaren sentsibilitatea garrantzitsua da arazo hau edo arazo hori dugulako, zer egin dezakegu RT-PCRren sentsibilitatea hobetzeko?
Konponbide posibleak eztabaidatu aurretik, aipatu berri dugun egoeraren bi konplikazio handi aipa ditzagun.
Lehenik eta behin, RNA galerarekin kezkatzen gara gure laginean zelula-populazio batzuk baino ez ditugunean.Banatze- eta garbiketa-metodo tradizionalak erabiltzen badira, zutabe-metodoa edo azido nukleikoen prezipitazio-metodoa adibidez, lagin gutxi galtzeko aukera handia dago.Irtenbide bat molekula eramaile bat gehitzea da, hala nola tRNA, baina hala ere, ez dago bermerik gure berreskuratze-esperimentua ondo dagoenik.
Beraz, zein da bide hobea?Zelula hazietarako edo lagin mikroanatomikoetarako aukera ona lisis zuzena erabiltzea da.
Ideia da zelulak 5 minutuz zatitzea, RNA disoluzioan askatzea, gero erreakzioa gelditzea 2 minutuz, gero lisatua zuzenean alderantzizko transkripzio-erreakziora gehitzea, RNArik ez galtzeko eta, azkenik, sortutako cDNA zuzenean jarri. denbora errealeko erreakzioan sartu.
Baina zer gertatzen da, abiapuntu mugatu batengatik edo xede geneen adierazpen kopuru txiki bat dela eta, RNA guztia birzikla dezakegu eta oraindik ez badugu nahikoa txantiloi eman denbora errealeko seinale on bat lortzeko?
Kasu honetan, aurre-anplifikazio urratsa oso erabilgarria izan daiteke.
Alderantzizko transkripzioaren ondoren sentikortasuna areagotzeko eskema bat da honakoa.Hasi baino lehen, ibaian behera zein helburu interesatzen zaizkigun galdetu behar dugu, diseinatzaile espezifikoak diseinatzeko xede horiei aurre-anplifikaziorako.
Hau lortu daiteke 100 pare arte eta 10 eta 14 aldiz arteko erreakzio zikloa sortuz.Hori dela eta, baldintza honetarako bereziki diseinatutako Master Mix bat behar da lortutako cDNA aurre-anplifikatzeko.
Ziklo kopurua 10 eta 14 artean ezartzearen arrazoia da ziklo kopuru mugatu horrek helburu ezberdinen arteko ausazkotasuna bermatzen duela, eta hori funtsezkoa da informazio molekular kuantitatiboa behar duten ikertzaileentzat.
Aurreanplifikazioaren ondoren, cDNA kopuru handi bat lor dezakegu, atzeko aldean detektatzeko sentsibilitatea asko hobetu dadin, eta lagina diluitu eta denbora errealeko PCR erreakzio anitz egin ditzakegu ausazko akatsak ezabatzeko.
Argitalpenaren ordua: 2023-04-11